Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
2.5.33. ОБЩИЙ БЕЛОК
Многие из методов анализа, которые описаны в данном разделе, могут выполняться с использованием наборов, производимых изготовителями.
МЕТОД 1
Белок в растворе поглощает ультрафиолетовый свет при длине волны 280 нм благодаря присутствию в структуре ароматических аминокислот, главным образом тирозина и триптофана Это свойство белков может использоваться в целях их определения. Если буферный раствор, используемый для разведения белка, имеет большую оптическую плотность, относительно плотности воды, в нем присутствует интерферирующее вещество. Эту интерференцию можно устранить, если использовать буферный раствор в качестве раствора сравнения, но, если интерферирующее вещество проявляет высокую оптическую плотность, результаты могут быть подвергнуты сомнению. При низких концентрациях белок может сорбироваться на кювете, что приводит к существенному занижению концентрации его в растворе. Этого можно избежать, подготавливая образцы с высокой концентрацией или используя детергенты неионного характера.
Исследуемый раствор. Необходимое количество исследуемого вещества, растворяют в соответствующем буферном растворе для получения раствора с концентрацией белка в диапазоне от 0,2 мг/мл до 2 мг/мл.
Стандартный раствор. Готовят раствор соответствующего стандартного вещества для определяемого белка с тем же буферным раствором и в той же концентрации, как исследуемый раствор.
Методика. Во время выполнения данного исследования испытуемый раствор, стандартный раствор и раствор сравнения хранят при одинаковой температуре. Определяют оптическую плотность (2.2.25.) исследуемого раствора и стандартного раствора в кварцевой кювете при длине волны 280 нм, используя необходимый буферный раствор в качестве раствора сравнения. Результаты исследования должны быть линейными в диапазоне концентраций исследуемого белка.
Обработка полученных результатов. Точность определения белка может быть снижена за счет светорассеивания раствора исследуемого образца. Если белок в растворе существует в виде частиц, сопоставимых по размерам с длиной волны измеряемого света (250 нм - 300 нм), рассеивание светового потока приводит к очевидному увеличению оптической плотности исследуемого образца. Чтобы рассчитать оптическую плотность при длине волны 280 нм с учетом светорассеяния, определяют оптическую плотность исследуемого раствора при следующих длинах волн - 320 нм, 325 нм, 330 нм, 335 нм, 340 нм, 345 нм и 350 нм. Находят логарифмическую функцию полученной оптической плотности к длине волны и по соответствующим точкам строят график линейной регрессии. Экстраполируют данные, снятые с графика, чтобы определить логарифм оптической плотности при длине волны 280 нм. Антилогарифмом данного значения является оптическая плотность, определенная светорассеянием. Для получения оптической плотности белка в растворе корректируют наблюдаемые значения вычитанием оптической плотности, определяемой светорассеянием, из общей оптической плотности, измеренной при длине волны 280 нм. Фильтрование с использованием фильтра 0,2 мкм не поглощающего белок, или осветление центрифугированием, могут применяться для снижения эффекта светорассеяния, особенно в случае явной мутности раствора.
Расчеты. Для расчетов используют откорректированные значения. Рассчитывают концентрацию белка в исследуемом растворе (Си), используя уравнение:
C = с Аи си = cs ~: 5
As
где:
Си - концентрация белка в исследуемом растворе;
CS - концентрация белка в стандартном растворе;
Аи и As - откорректированные значения оптической плотности исследуемого и стандартного раствора, соответственно.
МЕТОД 2
Данный метод (обычно называемый методом Лоури).
# Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.
Развитие окраски достигает своего максимума через 20-30 мин при комнатной температуре, после чего происходит постепенное обесцвечивание. Поскольку данный метод является чувствительным к интерферирующим веществам, можно использовать процедуру для осаждения белка из исследуемой пробы. Большинство интерферирующих веществ вызывают слабое окрашивание, хотя применение
некоторых детергентов может вызывать усиление цвета. Поскольку различные белки могут давать цветовые реакции различной эффективности, стандартное вещество и исследуемый белок должны быть одинаковыми. В тех случаях, когда необходимо отделение интерферирующих веществ от белка в исследуемой пробе, используют процедуру, описанную ниже для интерферирующих веществ перед тем, как подготовить исследуемый раствор. Эффект интерферирующих веществ может быть минимизирован с помощью разведения, обеспечивающего концентрацию исследуемого белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений.
Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе используют воду дистиллированную Р.
